Der Einfluss von Rho GTPasen auf die Toll-Like Rezeptor (TLR) – induzierte Zytokinproduktion von murinen Knochenmarkmakrophagen

Please use this identifier to cite or link to this item:
https://osnadocs.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2014112412949
Open Access logo originally created by the Public Library of Science (PLoS)
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorProf. Dr. Michael Hensel
dc.creatorSchulz, Anette
dc.date.accessioned2014-11-24T09:34:33Z
dc.date.available2014-11-24T09:34:33Z
dc.date.issued2014-11-24T09:34:33Z
dc.identifier.urihttps://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2014112412949-
dc.description.abstractToll-Like Rezeptoren (TLR) erkennen Motive von diversen Komponenten (Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren) von Mikroorganismen, Viren und wirtseigenen Zellen, die als Agonisten eine Signalkaskade induzieren. Diese Agonisten werden als PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns) oder DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) bezeichnet. Werden TLRs stimuliert, kommt es zur Aktivierung von Signalkaskaden, die in einer agonistenspezifischen Freisetzung charakteristischer Muster von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen münden. Infektionserreger haben unterschiedliche Strategien entwickelt, um mittels Pathogenitätsfaktoren die Erkennung durch Immunzellen und damit der Wirtsimmunantwort zu umgehen. Yersinien, Salmonellen und Shigellen injizieren über Typ 3 Sekretionssysteme (T3SS) Effektorproteine in Wirtszellen und modifizieren die Aktivität von Rho GTPasen. Bisher wurden diese T3SS-Effektoren hinsichtlich Phagozytoseaktivierung bzw. -inhibition untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Frage untersucht, welche Rolle die Rho GTPasen von primären murinen Makrophagen für die TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort haben könnten. Für diesen Zweck wurden erstmalig M-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (M-MΦ) sowie GM-CSF differenzierte Knochenmarkmakrophagen (GM MΦ) mit gendeletierten Rho GTPasen Rac1, RhoA, Rac1/RhoA sowie Cdc42 auf ihre Zytokinantwort nach PAMP (LPS, Pam3CSK4 und CpG) -Stimulierung untersucht. Für die konditionale Gendeletion wurden Mäuse mit „gefloxten“ Rho GTPase-Genen mit LysMCre Mäusen zur zellspezifischen Gendeletion gekreuzt. Die Aktivität des LysM-Promotors wurde in M-MΦ und GM-MΦ aus LysM-eGFP knockin Mäusen überprüft. Dabei wurde nachgewiesen, dass eine LysMCre abhängige Gendeletion mit nachfolgender Depletion von Rho GTPasen sowohl in M-MΦ als auch in GM-MΦ mit sehr hoher Effizienz entsteht. Interessanterweise zeigten GM-MΦ, die in der Literatur auch als DCs bezeichnet und damit keinen aktiven LysM Promotor haben sollten (Clarke and Gordon, 1998), ein starkes LysM-eGFP Signal und wiesen auch Rho GTPase-Gendeletionen auf. Bei den GM-MΦ handelt es sich wahrscheinlich um eine Mischpopulation unterschiedlich differenzierter MΦ-Subpopulationen, die keine klare PAMP/TLR-Signalantwort erwarten lassen. Neben der Verwendung von primären Knochenmarkzellen sollte geprüft werden, ob HoxB8 immortalisierte Knochenmarkzellen (Wang et al., 2006) von konditionalen Rho GTPase-knockout Mäusen ebenso für die TLR Fragestellung verwendet werden können. Das Wachstumsverhalten sowie die Oberflächenmarker der immortalisierten GM-iMΦ ähneln dem der primären GM-MΦ (Rosas et al., 2011), jedoch nicht das Zytokinsekretionsmuster nach TLR-Stimulierung. Da auch die immortalisierten GM-iMΦ heterogene Populationen bilden, wurde auf eine weitere Analyse hinsichtlich der PAMP-Zytokinantwort verzichtet und die Analyse auf primäre M-MΦ fokussiert. In M MΦ(Rac1-/-) und M-MΦ(RhoA-/-) konnten eindeutige Unterschiede zu M-MΦ (wt) und damit eine wichtige Rolle der Rho GTPasen bei der TLR-Signalkaskade und Zytokinantwort in M-MΦ nachgewiesen werden. Die 6 h-Stimulierung mit den spezifischen TLR2-, TLR4- bzw. TLR9-Agonisten Pam3CSK4, LPS bzw. CpG führte in M-MΦ(Rac1-/-) zu verstärkter IL-10 Sekretion (exkl. TLR2), in M MΦ(RhoA-/-) dagegen zu verstärkter IL-12 Sekretion. Nach 24 h-Stimulierung mit den verschiedenen TLR-Agonisten sind die Zytokinmuster für die M-MΦ(wt) und Rho GTPase-deletierten M-MΦ ähnlich (exkl. für IL-10 nach TLR2- und TLR9-Stimulierung). Yersinien injizieren mittels T3SS-Injektisome den Rac1-Inhibitor YopE (Rac-GAP) und den Rho GTPasen-Inhibitor YopT (proteolytische Spaltung des C-terminalen prenylierten Cystein-Membranankers, bevorzugt von RhoA), was zur Inhibition der Rho GTPasen der kontaktierten Phagozyten führt. Es wurden deshalb auch die Zytokinmuster nach TLR-Stimulierung von M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) bestimmt. Im Vergleich zu M-MΦ(wt) war die IL-12 Antwort praktisch unverändert, während die TNFα und die IL-6 Antwort der M-MΦ (Rac1-/-/RhoA-/-) erhöht waren. Mit diesen Ergebnissen der Rac1- und RhoA-abhängigen Freisetzung von proinflammatorischen und antiinflammatorischen Zytokinen durch M-MΦ können jetzt gezielte infektionsbiologische Untersuchungen z.B. mit Yersinien durchgeführt werden, um die pathogenetische Bedeutung der mikrobiellen Modulation der Rho GTPasen auf die Wirtsabwehr bzw. Zytokinantwort zu analysieren.ger
dc.rightsNamensnennung-NichtKommerziell-KeineBearbeitung 3.0 Unported-
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/-
dc.subjectTLRger
dc.subjectRho GTPasenger
dc.subjectKnochenmarkmakrophagenger
dc.subjectZytokineger
dc.subject.ddc570 - Biowissenschaften; Biologie
dc.titleDer Einfluss von Rho GTPasen auf die Toll-Like Rezeptor (TLR) – induzierte Zytokinproduktion von murinen Knochenmarkmakrophagenger
dc.title.alternativeInfluence of Rho GTPases on Toll-Like Receptor (TLR) – induced cytokine production of murine macrophageseng
dc.typeDissertation oder Habilitation [doctoralThesis]-
thesis.locationOsnabrück-
thesis.institutionUniversität-
thesis.typeDissertation [thesis.doctoral]-
thesis.date2014-10-24-
dc.contributor.refereeProf. Dr. Dr. Jürgen Heesemann
dc.subject.bk42.30 - Mikrobiologie
dc.subject.bk44.45 - Immunologie
ddb.annotationToll-like Receptors (TLRs) recognize diverse patterns (proteins, lipoproteins, lipopolysaccharides, nucleic acids) of microorganisms, viruses and host cells, which are able to induce intracellular signaling cascades. These TLR agonists are known as PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), MAMPs (microbe-associated molecular patterns) or DAMPs (damage-associated molecular patterns). The stimulation of TLRs induces a signaling cascade that leads to specific, agonist-dependent secretion of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. Pathogens have developed different strategies, e.g. expression of virulence factors in order to avoid the recognition by immune cells and to bypass the host immune response. Gram-negative enterobacteria like Yersinia, Salmonella and Shigella inject effector proteins via their type 3 secretion systems (T3SS) into the host cell. These effector proteins are able to modulate the activity of Rho GTPases. Until now, T3SS effectors were analyzed regarding activation or inhibition of phagocytosis. In this study, we investigated the role of Rho GTPases on the TLR signaling cascade and cytokine response in primary murine macrophages. For this purpose, we used M-CSF differentiated bone marrow derived macrophages (M-MΦ) and GM-CSF differentiated bone marrow macrophages (GM-MΦ) with gene deletions of Rho GTPases Rac1, RhoA, Rac1/RhoA or Cdc42 and analyzed cytokine secretion after PAMP (Pam3CSK4, LPS and CpG) stimulation. For conditional cell specific gene deletions, mice with floxed genes for Rho GTPase were crossed with LysMCre mice. The activity of the LysM promoter was examined in M-MΦ and GM-MΦ of LysM-eGFP knockin mice. We show that in M-MΦ and GM-MΦ, a LysMCre-dependent gene deletion of Rho GTPases can be induced with high efficiency. Interestingly, GM-MΦ, also known as bone marrow derived dendritic cells (BMDC) that should not have LysM promoter activity, show a strong LysM-eGFP signal and depletion of Rho GTPases. Since GM-MΦ are most probably a mixed population of unequally differentiated subpopulations of macrophages, a clear PAMP/TLR-signaling response cannot be expected. In addition to primary bone marrow cells, we used HoxB8 immortalized cells (Wang et al., 2006) of conditional knockout mice to investigate the cytokine secretion pattern after PAMP stimulation. Growth behavior and expression of surface markers is similar on primary and immortalized macrophages (Rosas et al., 2011) but the cytokine secretion pattern after TLR stimulation is different in Rho GTPase-depleted cells. Since immortalized GM-iMΦ form a heterogeneous population just as the primary GM-MΦ, we focused on M-MΦ for further cytokine response analysis. In M MΦ(Rac1-/-) and M-MΦ(RhoA-/-) compared to M-MΦ(wt) we demonstrate clear differences and therefore an important role in TLR signaling and cytokine response. Stimulation for 6 h of TLR2, TLR4 and TLR9 with their specific agonists Pam3CSK4, LPS or CpG led to enhanced secretion of IL-10 in M-MΦ(Rac1-/-) (excl. TLR2) and to enhanced secretion of IL-12 in M-MΦ(RhoA-/-). Cytokine secretion patterns after stimulation for 24 h with the specific TLR-agonists was similar for M-MΦ(wt) and Rho GTPase depleted M-MΦ, except for IL-10 after TLR2 and TLR9 stimulation. Yersinia enterocolitica injects the Rac1 inhibitor YopE (Rac1-GAP) and the Rho GTPase inhibitor YopT (proteolytic cleavage of C-terminal prenylated cysteine membrane anchor, preferably RhoA) via its T3SS, which leads to inhibition of Rho GTPases in phagocytes after bacterial contact. Therefore, we determined the cytokine pattern after TLR stimulation in M-MΦ(Rac1-/-/RhoA-/-). Compared to M-MΦ(wt) the IL-12 response in M-MΦ(Rac1-/-/RhoA-/-) was nearly unchanged, but the TNFα and IL-6 response was enhanced. With these results of Rac1 and RhoA dependent release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines by M-MΦ, infectious biological investigation e.g. with Yersinia can be performed in order to analyze the pathogenetic significance of microbial induced Rho GTPase modulation on host defense or cytokine response.eng
vCard.ORGFB5
Appears in Collections:FB05 - E-Dissertationen

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
thesis_schulz.pdfPräsentationsformat5,01 MBAdobe PDF
thesis_schulz.pdf
Thumbnail
View/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons