Untersuchungen zur Stimulus-Wahrnehmung und Regulation des Zweikomponenten-Systems KdpD/KdpE aus Escherichia coli

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Title: Untersuchungen zur Stimulus-Wahrnehmung und Regulation des Zweikomponenten-Systems KdpD/KdpE aus Escherichia coli
Authors: Laermann, Vera
Thesis advisor: Prof. Dr. Karlheinz Altendorf
Thesis referee: Prof. Dr. Gottfried Unden
Abstract: Unter K+-limitierenden Wachstumsbedingungen oder, in wesentlich geringerem Ausmaß, unter Salzstress synthetisiert E. coli den KdpFABC-Komplex, ein hoch-affines K+-Transportsystem (Km ~ 2μM). Die Regulation der Expression des kdpFABC-Operons erfolgt durch das Sensorkinase/Antwortregulator-System KdpD/KdpE. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Identifizierung des Stimulus, der von der Sensorkinase KdpD wahrgenommen wird. Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Beobachtung, dass die K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM inhibiert wird. Diese wichtige Eigenschaft des Kdp-Systems wurde in der Vergangenheit häufig übersehen, da die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren pH-Werten (pH 7,8) durch eine hohe Rate unspezifischen K+-Transports kompensiert und somit überdeckt wird. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Aspartat-Substitutionen in den periplasmatischen Schleifen der Sensor-Domäne von KdpD ausreichten, um die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren K+-Konzentrationen aufzuheben. Diese KdpD-Derivate zeigten eine, im Vergleich zum KdpD-WT, veränderte Regulation der kdpFABC-Expression bei K+-Konzentrationen >5 mM, die eine adäquate K+-Aufnahme via KdpFABC ermöglichte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM auf einer Inhibierung der kdpFABC-Expression durch KdpD basiert. Weiterhin konnte gezeigt werde, dass eine Abnahme der extrazellulären K+-Konzentration eine effiziente und sofortige Stimulierung der KdpD/KdpE-Signaltransduktion bewirkt. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass die extrazelluläre K+-Konzentration als Reiz für die Sensorkinase KdpD dient. Im zweiten Teil dieser Arbeit erfolgte erstmals eine absolute Quantifizierung von KdpD und KdpE, sowie der Untereinheiten des KdpFABC-Komplexes unter induzierenden und nicht-induzierenden Bedingungen mittels hoch-sensitiver und selektiver Massenspektrometrie. Unter nicht-induzierenden Bedingungen liegt die KdpFABC-Synthese in der gleichen Größenordnung wie die KdpD- und KdpE-Synthese vor. Dieser Befund ist eine wichtige Voraussetzung für die postulierte, regulatorische Interaktion zwischen der Sensorkinase KdpD und der K+-Transportuntereinheit KdpB (Kipschull, 2011). Unter induzierenden Bedingungen stieg die KdpFABC-Synthese 100-300-fach, während eine etwa 10-fache Erhöhung der KdpD- und KdpE-Synthese nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung bestätigt, dass das Zweikomponenten-System KdpD/KdpE unter induzierenden Bedingungen einer Autoregulation unterliegt. Die Autoregulation konnte durch eine räumliche Trennung des kdpFABC- und kdpDE-Operons aufgehoben werden. Die Aufhebung der Autoregulation von KdpD/KdpE hatte jedoch keinen Einfluss auf die Expressionskinetik des kdpFABC-Operons unter induzierenden Bedingungen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt die Konstruktion eines E. coli-Stamms, der eine vollständige Deletion des kdpD-Gens trägt. Nach einer zeitlichen Verzögerung konnte in dem daraus resultierenden E. coli-Stamm (LB2240ΔkdpD) unter K+-Limitation eine KdpD-unabhängige Expression des kdpFABC-Operons nachgewiesen werden. Die kdpFABC-Expression befähigte diesen Stamm, in Abwesenheit von KdpD unter K+-Limitation zu wachsen. Es konnte gezeigt werde, dass das K+-limitierte Wachstum von LB2240ΔkdpD eine Phosphorylierung von KdpE voraussetzt, wobei Acetylphosphat nicht als alternativer Phosphodonor diente. Da nur wenige Zellen einer LB2240ΔkdpD-Kultur den beschriebenen Phänotyp zeigten, liegt die Vermutung nahe, dass diese Zellen Träger einer Suppressormutation sind, die eine KdpD-unabhängige Phosphorylierung von KdpE und daraus folgend eine kdpFABC-Expression verursacht.
URL: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2014081112672
Subject Keywords: Sensorkinase; Zweikomponenten-System; K+; Stimulus; two-component system; potassium
Issue Date: 11-Aug-2014
Type of publication: Dissertation oder Habilitation [doctoralThesis]
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