osnaDocs: Elektrophysiologische und biochemische Charakterisierung von rekombinanten und nativen Kanalproteinen aus der inneren Chloroplasten-Hüllmembran und dem Cyanobakterium Synechocystis

Elektrophysiologische und biochemische Charakterisierung von rekombinanten und nativen Kanalproteinen aus der inneren Chloroplasten-Hüllmembran und dem Cyanobakterium Synechocystis

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https://osnadocs.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2001052319

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DC Element	Wert	Sprache
dc.contributor.advisor	Prof. Dr. Richard Wagner
dc.creator	Mehrle, Alexander
dc.date.accessioned	2010-01-30T14:39:16Z
dc.date.available	2010-01-30T14:39:16Z
dc.date.issued	2001-05-23T11:15:40Z
dc.date.submitted	2001-05-23T11:15:40Z
dc.identifier.uri	https://osnadocs.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2001052319	-
dc.description.abstract	Elektrophysiologische und biochemische Charakterisierung von rekombinanten und nativen Kanalproteinen aus der inneren Chloroplasten-Hüllmembran und dem Cyanobakterium Synechocystis In der vorliegenden Arbeit wurden zwei angenommene Kaliumkanäle heterolog exprimiert und untersucht. Außerdem wurde die elektrophysiologische Charakterisierung des am Proteinimport beteiligten Proteins Tic110 durchgeführt. Ergänzt wurden diese Experimente durch eine elektrophysiologische Charakterisierung von Ionenkanälen in der inneren Chloroplasten-Hüllmembran. Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in Arabidopsis thaliana konnten zwei Gene identifiziert werden, die wahrscheinlich Kaliumkanäle codieren. Das Genprodukt aus Arabidopsis ist wahrscheinlich im Chloroplasten lokalisiert und besitzt sechs putative transmembrane Durchgänge. Es ähnelt strukturell den Kaliumkanälen AKT1 und KAT1. Der potentielle Synechocystis-Kanal besitzt aufgrund von Sekundärstrukturvorhersagen Ähnlichkeit mit dem Kaliumkanal KcsA aus Streptomyces lividans und eukaryontischen Kanälen der IRK-Familie. Beide Proteine wurden als His-Tag Fusionsproteine in Baculovirus-infizierten Sf21-Insektenzellen überexprimiert und konnten in der Membranfraktion der Zellen nachgewiesen werden. Patch-Clamp-Messungen in der ’Whole-Cell’ und ’Excised-Patch’ Konfiguration an den Insektenzellen zeigten, dass keine funktionellen Kanäle in der Plasmamembran lokalisiert waren. Beide Kanäle konnten mittels nicht-ionischer Detergentien solubilisiert werden, aber nur der Synechocystis-Kanal konnte mittels Ni-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Nach Rekonstitution des Proteins in Azolektin-Liposomen zeigte sich bei Messungen im Bilayer-System jedoch keine Kanalaktivität. Ursache hierfür ist wahrscheinlich eine zu geringe Offenwahrscheinlichkeit des Proteins oder eine nicht funktionelle Rekonstitution. Weiterhin wurden bei elektrophysiologischen Messungen mit der Bilayer-Methode Ionenkanäle in der isolierten inneren Hüllmembran von Chloroplasten untersucht. Es konnte die Existenz eines Kaliumkanals bestätigt sowie zwei bisher unbekannte Kanäle (CIMCC1 und CIMCC2) charakterisiert werden. CIMCC1 ist mäßig selektiv für Kationen (PK/PCl = 3.5), besitzt einen Haupt- und einen Unterleitwert von 680 bzw. 330 pS (in 250 mM KCl) und eine spannungsunabhängige Offenwahrscheinlichkeit von 70 %. Der Kanal könnte aufgrund seiner Eigenschaften am Transport von Aminosäuren über die innere Chloroplasten-Hüllmembran beteiligt sein. CIMCC2 ist Kationen-selektiv (PK/PCl = 5.3), besitzt einen Leitwert von 600 pS (in 250 mM KCl) und schließt bei höheren positiven bzw. negativen Membranpotentialen. Der Kanal ist durch wenige 100 nM des Präpeptids Troe33 blockierbar, weshalb er eine Rolle im Import von Proteinen in den Chloroplasten spielen könnte. Ferner konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Protein Tic110 nach heterologer Expression in E. coli und Rekonstitution in Liposome eine hydrophile Pore bildet, deren Eigenschaften denen von Proteinimportkanälen in der äußeren Membran von Chloroplasten und Mitochondrien ähnelt. Aufgrund einer Sekundärstrukturvorhersage und des CD-Spektrums ist, im Gegensatz zu vorherigen Annahmen, eine von b-Faltblättern dominierte Sekundärstruktur wahrscheinlich. Der durch Tic110 gebildete Kanal ist Kationen-selektiv, hat einen Leitwert von 446 pS in 250 mM KCl und einen Porendurchmesser zwischen 15 und 34 Angström. Die spannungsabhängige Offenwahrscheinlichkeit ist maximal bei kleinen Membranpotentialen und nimmt zu höheren positiven und negativen Spannungen hin ab. Weiterhin ist der Kanal durch geringe Konzentrationen des Präpeptids Troe33 (ca. 100 nM) spezifisch hemmbar. Tic110 besitzt funktionell eine starke Ähnlichkeit mit CIMCC2 in der inneren Hüllmembran, was nahelegt, dass es sich hierbei um die gleichen Proteine handelt. Ausgehend von diesen Eigenschaften ist es wahrscheinlich, dass Tic110 die Proteinimportpore der inneren Chloroplasten-Hüllmembran darstellt.	ger
dc.language.iso	ger
dc.subject	Protein-Import
dc.subject	Kaliumkanäle
dc.subject	Chloroplast
dc.subject	innere Hüllmembran
dc.subject	Elektrophysiologie
dc.subject	Kanäle
dc.subject.ddc	570 - Biowissenschaften; Biologie
dc.title	Elektrophysiologische und biochemische Charakterisierung von rekombinanten und nativen Kanalproteinen aus der inneren Chloroplasten-Hüllmembran und dem Cyanobakterium Synechocystis	ger
dc.type	Dissertation oder Habilitation [doctoralThesis]	-
thesis.location	Osnabrück	-
thesis.institution	Universität	-
thesis.type	Dissertation [thesis.doctoral]	-
thesis.date	2001-03-30T12:00:00Z	-
elib.elibid	138	-
elib.marc.edt	fangmeier	-
elib.dct.accessRights	a	-
elib.dct.created	2001-05-09T15:16:20Z	-
elib.dct.modified	2001-05-23T11:15:40Z	-
dc.contributor.referee	Prof. Dr. Holger Lill
dc.subject.dnb	32 - Biologie	ger
vCard.ORG	FB5	ger
Enthalten in den Sammlungen:	FB05 - E-Dissertationen

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